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노스웨스턴 블롯

실험 방법의 종류
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노스웨스턴 블롯(영어: northwestern Blot)은 웨스턴 블롯과 노던 블롯의 하이브리드 분석 기술로 RNA와 단백질 간의 상호작용을 분석하는데 필요한 분석법이다. 웨스턴 블롯은 겔 전기 영동법에 의해 분리된 단백질을 나이트로셀룰로스 막으로 전달하고, 관심 단백질을 검출하는 데 사용한다. 특정 표적 단백질을 포함하는 막의 밴드를 보고 파악한다. 노던 블롯은 관심있는 RNA(또는 분리된 전령 RNA)를 탐지하여 유전자 발현을 연구하는 데 사용된다. 노스웨스턴 블랏은 두 기술을 결합하며, 나이트로셀룰로스 막에 고정된 단백질과 상호작용하는 RNA를 식별한다.

기술 특성 편집

노스웨스턴 블롯을 시행하는 것은 RNA 결합 단백질을 겔 전기영동으로 분리하는 것을 포함하는데, 이것은 분자량과 전하에 따라 RNA 결합 단백질을 분리한다. 개별 샘플은 여러 샘플을 동시에 분석하기 위해 아가로스 또는 폴리아크릴라미드 겔(일반적으로 SDS-PAGE)에 로딩할 수 있다.[1] 겔 전기 영동이 완료되면 RNA 결합 단백질이 나이트로셀룰로스 막에 전달된다.[2]

새로 옮겨진 블롯은 차단 용액에 담근다. 무지방 우유와 소 혈청 알부민(BSA)이 일반적인 차단 완충제다.[3] 이 차단 용액은 나이트로셀룰로스 막에 대한 1차 항체 및 2차 항체의 비특이적 결합을 방지하는 데 도움이 된다. 차단 용액이 블롯과 적절한 접촉 시간을 가지면 특정 경쟁 RNA를 적용하여 상온에서 배양할 수 있는 시간을 준다. 이 시간 동안, 경쟁자 RNA는 블롯 위에 있는 샘플의 RNA 결합 단백질에 결합한다. 이 과정에서 배양 시간은 적용되는 경쟁 RNA의 농도에 따라 달라질 수 있다. 그러나 배양 시간은 일반적으로 1시간이다.[4] 배양이 완료된 후, 블럭은 용액의 RNA를 희석시키기 위해 세척할 때마다 최소 3회 이상 세척한다. 일반적인 세척 버퍼에는 PBS(Phosphate Buffered Saline) 또는 10% TWEEN-20 용액이 포함된다.[5] 제대로 하지 않은 세척은 블롯 발생의 명확성에 영향을 미친다. 세척이 완료되면 일반적으로 X선에 의해 블롯이 디벨롭된다.[6]

응용 편집

X선이나 자기 방사법을 이용하여 블롯을 디벨롭한 후 결과를 분석하여 단백질을 추가로 연구하기 위해 관심있는 RNA 결합 단백질의 대략적인 크기와 농도를 결정할 수 있다. 블롯에 있는 RNA 결합 단백질의 위치와 농도는 결과에 영향을 줄 수 있으며, 개발 후 밴드가 나타나는 경우도 있다. 이 밴드들은 연구자들이 관심 있는 RNA 결합 단백질의 크기와 농도를 결정하는데 도움을 줄 수 있다.[7] 단백질의 대략적인 크기가 알려지면 원래 샘플은 크로마토그래피 기계로 실행해 크기별로 분리할 수 있다.[8] 또 단백질이 분리되면 트립신(trypsin)으로 분해가 가능하며, 질량 분광법을 활용해 펩타이드를 배열해 특정 단백질의 정체성을 파악할 수 있다.[9]

장점과 단점 편집

노스웨스턴 블롯의 장점은 RNA를 결합하는 특정 단백질의 신속한 검출과 그 단백질들의 대략적인 분자량을 알 수 있다.[10] 노스웨스턴 블롯은 비용을 적게 들여 식별된 단백질을 검출할 수 있게 한다. 이 블롯은 일반적으로 연구의 첫 번째 단계로, 분자량이 알려지면 크로마토그래피와 같은 다른 방법을 통해 추가 연구를 가능하게 하기 때문이다. 노스웨스턴 블롯 또 다른 장점은 그것이 동족 리간드의 발현 라이브러리 구축에 도움을 준다는 것이다.[11]

단점은 RNA 결합 특성이 좋지 않은 일부 RNA-단백질 상호작용은 이 기법으로 검출되지 않을 수 있다는 것이다.[10] 또한 블로킹 절차는 3시간에서 5시간까지 걸릴 수 있다. 절차를 올바르게 수행하지 않으면 식별된 단백질의 불분명한 블롯을 초래할 수 있다. 또 단백질은 분리되어 나이트로셀룰로스 막으로 옮겨진 후에 행해야 한다. 또한 단백질이 겔에서 혼합되는 하나의 폴리펩타이드나 두 개의 서브 유닛으로 구성되어야 한다는 것이다.[12]

같이 보기 편집

각주 편집

  1. ↑ Rapley, R (2000). 《The Nucleic Acid Protocols Handbook》. Totowa, NJ: Humana Press Inc. 783쪽. ISBN 978-0-89603-459-4. 
  2. ↑ Verena, Bichsel; Alfred Walz; Matthias Bickel (1997). “Identification of proteins binding specifically to the 3'-untranslated region of granulocyte/macrophage-colony stimulating factro mRNA” (PDF). 《Nucleic Acids Research》 25 (12): 2417–2423. doi:10.1093/nar/25.12.2417. PMC 146745. PMID 9171094. 2014년 5월 7일에 확인함. 
  3. ↑ Liao, Huey-Jane; Ryuji Kobyashi and Michael B. Matthews; Mathews, M. B. (1998년 7월 21일). “Activities of adenovirus virus-associated RNAs: Purification and characterization of RNA binding proteins”. 《Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America》 95 (15): 8514–9. Bibcode:1998PNAS...95.8514L. doi:10.1073/pnas.95.15.8514. PMC 21107. PMID 9671709. 
  4. ↑ C, Franke; Grafe D; Bartsch H; Bachmann M (2009). 《Use of non-radioactive detection method for north- and southwestern blot》. Methods in Molecular Biology 536. 441–9쪽. doi:10.1007/978-1-59745-542-8_44. ISBN 978-1-934115-73-2. PMID 19378081. 
  5. ↑ Schumacher, Jill; Keesook Lee; Susanne Edelhoff; Robert Braun (May 1995). “Spnr, a Murine RNA-binding Protein That Is Localized to Cytoplasmic Microtubules”. 《The Journal of Cell Biology》 129 (4): 1023–1032. doi:10.1083/jcb.129.4.1023. PMC 2120489. PMID 7744952. 
  6. ↑ Stohlman, S A; R S Baric; G N Nelson; L H Soe; L M Welter; R J Deans (1988). “Specific interaction between coronavirus leader RNA and nucleocapsid protein”. 《Journal of Virology》. 11 62 (11): 4288–95. PMC 253863. PMID 2845141. 2019년 9월 13일에 원본 문서 (PDF)에서 보존된 문서. 2014년 3월 25일에 확인함. 
  7. ↑ Thangasamy, Saminathan. “Northwestern Blot of Protein-RNA Interaction from Young Rice Panicles”. 2014년 3월 26일에 확인함. 
  8. ↑ Perdew, Gary (2008년 8월 17일). 《Regulation of Gene Expression: Molecular Mechanisms》. Springer. 129쪽. ISBN 9781597452281. 
  9. ↑ Gary H. Perdew; Jack P. Vanden Heuvel; Jeffrey M. Peters (2008). 《Regulation of Gene Expression: Molecular Mechanisms》. Springer. 129쪽. ISBN 9781597452281. 
  10. ↑ 가 나 Smith, Christopher W.J. (1998). 《RNA-Protein Interactions : A Practical Approach: A Practical Approach》. Oxford University Press. 187쪽. ISBN 9780191591624. 
  11. ↑ Waldo, Cohen (1991년 8월 16일). 《Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology》. Academic Press. 186쪽. ISBN 9780080863290. 
  12. ↑ Nicholson, Allen W. (2001). 《Ribonucleases, Part A: Functional Roles and Mechanisms of Action: Functional Roles and Mechanisms of Action》. Academic Press. 409쪽. ISBN 9780080496917. 
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