중합효소 연쇄 반응: 두 판 사이의 차이

'''중합 효소 연쇄 반응'''(PCR: Polymerase Chain Reaction)은 [[DNA]]의 원하는 부분을 복제·증폭시키는 [[분자생물학]]적인 기술로, [[대장균]]이나 [[효모]] 같은 생물을 쓰지 않는 방법이다. 이 기술은 사람의 [[게놈]]과 같은 매우 복잡하며 양이 지극히 미량인 DNA 용액에서 연구자가 원하는 특정 DNA 단편만을 선택적으로 증폭시킬 수 있다. 또한 증폭에 필요한 시간이 2시간 정도로 짧으며, 실험 과정이 단순하고, 전자동 기계로 증폭할 수 있기 때문에, PCR과 여기서 파생한 여러가지 기술은 분자생물학, 의료, 범죄 수사, 생물의 분류 등 DNA를 취급하는 작업 전반에서 지극히 중요한 역할을 담당하고 있다. 1984년에 캐리 멀리스(Kary Mullis)가 특정 DNA 서열을 증폭하기 위한 방법을 고안하여 중합 효소 연쇄 반응(Polymerase Chain Reaction)이라고 불렀다. 1985년에 중합 효소를 클레나우 중합 효소(Klenow polymerase)로 사용하는 PCR이 처음 공식적으로 발표됐다. 클레나우 중합 효소는 열에 약했기 때문에 매 주기마다 효소를 새로 넣어 주어야 했고 생성물의 최대 길이는 400bp에 불과했다. 1988년에 DNA 중합 효소로 Thermophilus aquaticus라는 미생물의 DNA 중합 효소인 Taq를 사용한 논문이 발행되었다. 열에 강한 이 중합 효소는 PCR의 효율을 월등히 끌어올렸다. PCR에는 일련의 세 개의 단계가 있고 30~40회 정도 반복된다. PCR의 첫 번째 단계는 DNA를 변성(Denaturation)시키는 것이다. 두 가닥의 DNA는 가열함으로써 분리시킬 수 있다. 분리된 각각의 DNA는 주형(Template)으로서 역할을 하게 된다. 변성 온도는 DNA 내에 있는 G+C의 양과 길이에 따라 달라진다. PCR의 두 번째 단계는 어닐링결합(Annealing)이다. 이 단계에서는 [[시발체]](Primer)들이 주형 DNA에 결합을 하게 된다. 어닐링결합(Annealing) 온도는 반응의 정확성을 결정하는 중요한 요소인데 만약 온도를 너무 높게 하면 시발체가 주형 DNA에 너무 약하게 결합되어서 증폭된 DNA의 산물이 매우 적어진다. 또 만약 온도를 너무 낮게 하면 시발체가 비특이적으로[[비특이적 결합|비특이적]]으로 결합하기 때문에 원하지 않는 DNA가 증폭될 수 있다. PCR의 세 번째 단계는 신장(ExtensionElongation)단계이다. 이 단계에서 열에 강한 DNA 중합 효소가 주형 DNA에서 새로운 DNA를 만들게 된다. PCR은 DNA, RNA 그리고 단백질 수준의 PCR로 나뉠 수 있다. 보통 유전자를 얻는 실험을 할 경우, 그 유전자의 전체를 보려는 것이 아닌 유전자 안에서의 특정 유전자를 관찰하는 것이 목적이다. 하지만 DNA를 바로 PCR하게 되면 특정 유전자를 얻기 힘들고 진핵 생물의 경우, 비발현부위(인트론; Intron)가 같이 나오는 등 여러 가지 문제점이 있다. 그것을 해결하기 위해 특정 유전자에 시발체를 붙인 다음, PCR을 DNA수준이 아닌 RNA나 단백질 수준에서 하는 역전사-PCR 즉 RT(Reverse Transcriptase)-PCR이 있다.

94°C ~ 96°C로 가열하여 이중가닥[[단일가닥 DNA(ds|이중가닥 DNA]](dsDNA)를 [[단일가닥 DNA]](ssDNA)로 분리시킨다. 높은 온도일수록 ssDNA단일가닥 DNA 로 잘 이행되지만 Taq DNA polymerase도중합효소도 온도가 아주 높은 상태에서는 활성이변성되어 낮아질사용하지 못하게 될 수 있으므로 보통 94°C로 한다. 첫 번째 cycle에서는주기(cycle)에서는 확실한 변성을 위하여 약 5분간 지속시킨다.

===2. 시발체(Primer )의 결합 (Annealing)===

50°C ~ 65°C에서 진행된다. 염기간의[[시발체]](Primer)가 자신의 [[염기서열]]과 [[상보성(생물)|상보]]적인 염기서열을 갖고 있는 DNA에 결합하는 단계이다. [[염기]]간의 결합은 G와 C는 세 군데에서 수소결합이 일어나고, A와 T는 두 군데에서 결합이 일어나므로 G-C 결합이 A-T결합보다 강하다. 따라서 G+C 비율에 따라 결합온도에 변화를 주는 것이 좋다. 참고로 G-C 결합이 A-T결합보다 강하다. 사실 Primer를시발체를 만드는 것도 이 annealing결합 temperature를온도(Annealing Temperature)를 고려하여 합성해야 한다. 일반적으로 G-C content 가 50%가 되는 primer 쌍을 이용하는 것이 바람직하다. 보통 30초 가량 지속되는 이 단계에서 시발체의 [[DNA|5'→3'방향]]으로 DNA의 합성이 시작된다.

===3. DNA의 신장 (ExtentionElongation)===

70°C ~ 74°C에서 시행하며 원하는 PCR산물의 크기가 크거나 반응요소의 농도가 낮을 때에는 시간을 연장시킬 수도 있다. Taq polymerase는중합효소는 보통 1분에 2,000-4,000 nucleotides를염기쌍을 합성할중합할 수 있으므로 원하는 PCR산물의 크기 1kb마다 1분 정도의 시간을 배당하면 충분히 반응이 일어난다. 마지막 cycle에는 약 10분 정도 시간을 충분히 주는 것이 좋다.

===4. PCR의 역사= ==

PCR법에 대한 발상은 1983년에 캐리 멀리스(K. Mullis)에게서 처음 나왔다. 그는 초창기 생명공학 회사였던 시터스(Cetus)의 연구원이었으며 우연찮게 PCR법을 고안해서 발표하게 된다. 처음 멀리스는 여러 저명한 과학 저널에 PCR법을 투고했으나 채택되지 않았고 실제로 논문은 1987년에 처음 게재된다. 시터스사는 중합효소의 종류를 바꾸는 등, 해당 기술을 개량하고 발전시켜 큰 성공을 거두게 되지만 이후 PCR 기술 자체가 뒤퐁(DuPont)사나 로체(Roche)사, 프로메가(Promega)사가 연관된 여러 특허 분쟁을 일으키게 된다. 현재는 1992년에 특허권을 획득한 제약 회사 로체사에 PCR법의 특허가 있다. 개발자 멀리스는 PCR법을 고안한 공로로 1993년 노벨 화학상을 수상한다. 현재는 PCR법도 더욱 다양한 응용 기술이 개발되었다. 이러한 응용 기술로는 역전사 효소[[역전사효소]](reverse transcriptase)를 이용해서 RNA를 직접 증폭시키는 RT[[역전사-PCR이PCR]]이 대표적이며, 이외에도 형광 물질을 붙여서 PCR을 진행하며 관측되는 정량적인 변화를 이용하여 원래 DNA나 RNA의 양을 정확히 측정하는 정량적 PCR 또는 실시간 PCR, 한번에 수많은 PCR을 동시에 시행하는 대용량 PCR 같은 여러 방법이 있다.

===5. PCR법의 이용= ==

[[Image:PCR.svg|thumb|right|300px|'''Figure그림 21''': Schematic중합 효소 drawing연쇄 of반응에 the대한 PCR간단한 cycle도표. '''(1) Denaturing at변성 (94-96°C). (2) Annealing시발체의 at결합 (~65°C) (3) ElongationDNA의 at신장 (72°C)'''. Four4회의 cycles반복된 are실험이 shown표현되어 here있다. The파란 blue실선은 lines시발체(붉은 represent화살표)가 the결합되는, DNA복제하고자 template하는 to which primers[[주형(생물)|주형 DNA]](redTemplate arrowsDNA)를 anneal표시한다. that녹색 are extended by the동그라미는 DNA polymerase중합효소를 (light의미한다. green녹색 circles),화살표 to방향으로 give shorter새로운 DNA products 가닥(green녹색 lines실선),이 중합되고 있다. 이렇게 새롭게 which합성된 themselvesDNA가닥들은 are그 used스스로가 as새롭게 templates복제되는 asDNA의 PCR주형이 progresses된다.]]