히스태그
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히스태그(his tag)는 단백질 정제 방법 중 하나로 His서열이 이미 존재하는 벡터 DNA에 표적 유전자를 삽입하거나 표적 유전자의 5’ 또는 3’에 His서열을 붙이고 벡터에 넣어준다. 발현된 단백질에는 미리 달아둔 His-His-His-.....-His가 존재하게 되고, 이를 인식하는 항체(antibody)를 이용해서 정제할 수 있다.
원리 편집
일반적으로 단백질은 표면에 금속 이온을 조절할 수 있는 능력을 어느 정도 가지고 있으며, 친화성의 차이를 이용하여 크로마토그래피로 단백질을 분리하는 것이 가능하다. 이것은 1975년에 발표 된 고정화 금속 이온 친화성 크로마토그래피이다. 단백질을 구성하는 아미노산 중 히스티딘이 금속 이온과의 배위 결합에 강하게 관여한다는 연구 결과가 있다. 따라서 유전자 공학적으로 단백질의 말단에 다수의 히스티딘을 첨가하면 단백질의 금속 이온 친 화성이 현저히 증가하여 쉽게 정제가 가능하다. 히스태그를 갖는 단백질을 pH 8 이상의 조건 하에서 니켈 등의 금속 이온이 고정화 된 운반체에 접촉 시키면, 히스티딘 잔기가 금속 이온을 킬레이트 화하여 운반체에 결합한다. 다른 단백질은 운반체에 결합하지 않거나 아주 약하게 결합하기 때문에 운반체를 적절한 완충액으로 세척하여 제거할 수 있다. 그 후, 운반체로부터 이미다졸 등을 제거함으로써, 히스태그를 갖는 단백질을 고순도로 회수 할 수 있다.
장점 편집
히스태그의 장점은 태그가 매우 작으므로 다른 단백질에 결합되어도 단백질의 기능에 큰 영향을 미치지 않을 가능성이 높고 다른 복합 단백질과 함께 사용할 수 있으며 N말단과 C말단 모두 His를 넣어줄 수 있다. 또한 Solution 1ml당 결합하는 단백질의 양이 많으므로 정제 후에 매우 높은 농도로 단백질 농축이 가능하다.
단점 편집
히스태그의 단점은 비특이적 결합의 가능성이 있고 EDTA를 넣으면 2가 양이온들이 킬레이팅 되므로 니켈이 떨어져 나갈 수 있다. 또한 DTT(dithiothreitol)를 1mM 이상 버퍼에 넣을 경우 니켈이 환원되어 변색, 침색의 가능성이 있다.
추가방법 편집
일반적인 폴리 히스티딘 태그는 6개 히스티딘 잔기로 구성되며, 관심있는 단백질의 서열에서 C- 말단 또는 N- 말단에 첨가된다. 히스태그가 추가되는 자리는 단백질의 특성과 태그를 제거하는 방법에 달려 있다. 서열의 한쪽 끝이 단백질의 기능이나 구조에 중요한 경우에는 반대쪽 끝에 붙이도록 한다. 하지만 태그를 제거할 때 가장 유용한 exopeptidases는 N-말단에서만 히스태그를 제거할 수 있다.
폴리히스티딘을 추가하는 두 가지 방법이 있다. 가장 간단한 방법은 단백질을 암호화하는 DNA를 히스태그를 인코딩하는 벡터에 삽입하여 자동으로 그 말단 중 하나에 붙이는 것이다. 또 다른 기술은 꼬리표 붙이기 단백질을 코딩하는 DNA의 한쪽 말단에서 몇 개(16 개 이상)의 염기 이외에 개시코돈 또는 종결코돈 바로 옆에 반복 히스티딘 코돈이 있는 프라이머로 PCR을 수행하는 것이다.
