TA 클로닝

TA 클로닝 (TA cloning, 신속 클로닝 또는 T 클로닝 이라고도함)은 제한효소(restriction enzyme)의 사용을 피하는 서브클로닝 기술이다[1] . 이는 전통적인 서브클로닝보다 쉽고 빠르다. 이 기술은 다른 DNA 단편에서 아데닌(A)과 티민(T) (상보적 염기쌍)이 혼성화(hybridize)하고 결찰효소(ligase)의 존재하에 함께 결찰되는 능력에 의존한다. PCR 생성물은 일반적으로 생성물의 3 '말단에 아데닌을 우선적으로 첨가하는 Taq DNA 중합효소를 사용하여 증폭된다. 이러한 PCR 증폭된 인서트는 상보적인 3 ' 티민 돌출부를 갖는 선형화된 벡터로 클로닝된다.[2]

Diagram of TA Cloning.
TA 클로닝 도식

인서트(삽입물, insert) 만들기편집

인서트는 Taq 중합효소를 사용하여 PCR에 의해 생성된다. 이 중합효소는 3 '내지 5' 교정 활성(proofreading activity)이 없고, 높은 확률로 PCR 생성물의 각 말단에 단일 3'- 아데닌(A) 돌출부를 추가한다. 말단 프라이머 아데노신 오버행을 추가하는 Taq DNA 중합효소의 가능성을 최대화하기 때문에 PCR 프라이머에 5 '말단에 구아닌(G) 이 있는 것이 가장 좋다.[3] 광범위한 3 '내지 5' 엑소뉴클레아제(exonuclease) 활성을 함유하는 열 안정성 중합효소는 이들이 3 '아데닌 돌출부를 떠나지 않기 때문에 사용되어서는 안된다.[4]

벡터 만들기편집

표적 벡터는 선형화되고 블런트엔드(무딘 말단부, blunt-end) 제한 효소(restriction enzyme)로 절단한다. 이어서, 이 벡터는 말단 트랜스퍼라제(terminal transferase)를 사용하여 ddTTP로 꼬리가 난다. 하나의 T 잔류물만 추가하기 위해 ddTTP를 사용하는 것이 중요하다. 이 꼬리는 각 블런트엔드에 단일 3'- 오버행 티민(T) 잔기를 갖는 벡터를 남긴다.[5] 제조업체는 일반적으로 이미 선형화되고 돌출된 티민으로 태그가 지정된 광범위한 준비된 벡터가있는 TA 클로닝 "키트"를 판매한다.

장점과 단점편집

선형화된 벡터를 생성하는 것 이외의 제한 효소가 필요하지 않다면, 절차는 기존의 서브 클로닝 보다 훨씬 간단하고 빠르다. 프라이머를 설계할 때 제한 부위를 추가 할 필요가 없으므로 더 짧은 프라이머를 사용하여 시간과 비용을 절약 할 수 있다. 또한 전통적인 복제에 사용할 수 있는 실행 가능한 제한 사이트가없는 경우 TA 복제가 종종 대안으로 사용된다. TA 클로닝의 주요 단점은 방향성 클로닝이 불가능하므로 유전자가 50 %의 반대 방향으로 클로닝 될 가능성이 있다는 것이다.[1]

  1. “Improved TA Cloning”. Caister Academic Press. 2011년 7월 8일에 원본 문서에서 보존된 문서. 2009년 10월 17일에 확인함. 
  2. “TA Cloning”. 《www.premierbiosoft.com》. 2017년 2월 5일에 확인함. 
  3. “TA cloning protocol”. Durham, New Hampshire, USA: Hubbart Center for Genomic Studies. 2008년 12월 2일에 원본 문서에서 보존된 문서. 2009년 10월 17일에 확인함. 
  4. “TA Cloning Kit Manual” (PDF). Invitrogen. 2004년 4월 7일. 31쪽. 2010년 6월 24일에 원본 문서 (PDF)에서 보존된 문서. 2009년 10월 17일에 확인함. 
  5. Holton, T.A.; Graham, M.W (1991년 3월 11일). “A simple and efficient method for direct cloning of PCR products using ddT-tailed vectors”. 《Nucleic Acids Research》 19 (5): 1156. doi:10.1093/nar/19.5.1156. PMC 333802. PMID 2020554.